關(guān)鍵詞：成纖維細(xì)胞；誘導(dǎo)神經(jīng)元；誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞

如何把皮膚細(xì)胞變成神經(jīng)細(xì)胞？這是2005年Science雜志125周年慶的125個(gè)科學(xué)前沿問(wèn)題中的一個(gè)重大問(wèn)題。在對(duì)這個(gè)問(wèn)題的描述中，作者把細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化比做中世紀(jì)煉金術(shù)士的點(diǎn)金術(shù)，并且在文章結(jié)束時(shí)說(shuō)：“搞清楚大約25000個(gè)人類基因是如何共同工作形成組織，以及如何正確的引導(dǎo)未成熟細(xì)胞的培養(yǎng)，將會(huì)花費(fèi)研究者們數(shù)十年的時(shí)間，但一旦成功，這個(gè)成果將比黃金珍貴得多［1］”。

神經(jīng)系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和植物神經(jīng)系統(tǒng)，許多因素如感染、中毒、免疫損傷、營(yíng)養(yǎng)障礙、內(nèi)分泌紊亂以及遺傳因素等都可使神經(jīng)系統(tǒng)受損，神經(jīng)細(xì)胞的變性、凋亡或者壞死，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙或者缺失。由于神經(jīng)細(xì)胞的不可再生性，神經(jīng)損傷的修復(fù)是一個(gè)世界性難題，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，曾經(jīng)很長(zhǎng)一段時(shí)期被認(rèn)為是無(wú)法修復(fù)的。神經(jīng)元廣泛丟失或者脫髓鞘以后，神經(jīng)系統(tǒng)很難自我修復(fù)，臨床上一直缺乏有效的治療手段。利用干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞）研究神經(jīng)的修復(fù)一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。其中包括胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)以及成體細(xì)胞的細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換獲得神經(jīng)細(xì)胞等多種方法。其中成體細(xì)胞的細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換即將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)換成神經(jīng)細(xì)胞相對(duì)來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)效率更高，分化更完全，有效的降低了成瘤性，是一種更高效和更安全的誘導(dǎo)方法。

1.    神經(jīng)元的誘導(dǎo)

1.1. 2010年斯坦福大學(xué)的MariusWernig等人，用類似Yamanaka的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的技術(shù)，用Ascl1、Brn2/4和Myt1L（ABM）三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子成功的把小鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為了誘導(dǎo)神經(jīng)元（induced neurons，iNs）［2］。這是在這個(gè)領(lǐng)域的一次開(kāi)創(chuàng)性成果，以后的許多研究都是追隨著這個(gè)研究。Marius Wernig等人的研究用的是直接轉(zhuǎn)分化的方法，這種方法繞過(guò)了多潛能細(xì)胞或前體細(xì)胞，將一種類型的成體細(xì)胞直接跨譜系轉(zhuǎn)化成了另一種成體細(xì)胞。這種方法縮短了誘導(dǎo)時(shí)間，操作比較簡(jiǎn)單，致瘤性和免疫原性也比較小。用這種方法可以成功的誘導(dǎo)多種神經(jīng)元細(xì)胞。

1.2. 帕金森病是嚴(yán)重危害老年人的一種退行性神經(jīng)疾病，多巴胺能神經(jīng)元是帕金森病的關(guān)鍵細(xì)胞，在帕金森病人的中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，使得紋狀多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞顯著減少，如果能修復(fù)或者再生可以持續(xù)分泌多巴胺的神經(jīng)元就能治療這個(gè)疾病。2011年，丁勝及其團(tuán)隊(duì)用miR-124和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子MYT1L和BRN2成功的用胎兒成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出了多巴胺能神經(jīng)元［3］。2014年Maria Teresa Dell’Anno和她的同事們用Ascl1、Nurr1和Lmx1a誘導(dǎo)出了有功能的誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元，并把它們移植到了帕金森病模型大鼠的體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些誘導(dǎo)出來(lái)的小鼠可以長(zhǎng)期存活，并且確實(shí)改善了這些大鼠的運(yùn)動(dòng)功能［4］。

1.3. 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損會(huì)引起一些外周性神經(jīng)疾病，比如折磨著著名理論物理學(xué)家霍金的肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）等，修復(fù)和再生運(yùn)動(dòng)性神經(jīng)元就是治療這一類疾病的關(guān)鍵，Esther Y. Son等人用ABM加上了一些特異性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的因子把人和大鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（induced motor neurons ，iMNs），這些iMNs具有神經(jīng)電生理特性并能形成突觸，把它們移植到肌萎縮側(cè)索硬化癥的模型小雞的脊髓中后，發(fā)現(xiàn)有80%存活的iMNs從神經(jīng)根向周圍的肌肉組織伸出了突觸［5］。

2. 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)

除了神經(jīng)元細(xì)胞，成纖維細(xì)胞還可以轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，比如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和施旺細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，在神經(jīng)回路的發(fā)育和維持中有重要作用，有一定的再生功能。星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受損會(huì)引起類似ALS這樣的神經(jīng)退行性疾病，甚至有報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞與自閉癥和精神分裂癥有關(guān)。少突膠質(zhì)細(xì)胞形成了包繞神經(jīng)元軸突的“電線”外皮，功能異常會(huì)導(dǎo)致像多發(fā)性硬化癥這樣的脫髓鞘病變。施旺細(xì)胞的作用也是包繞髓鞘，對(duì)周圍神經(jīng)的再生意義重大。

2015年MassimilianoCaiazzo等在眾多轉(zhuǎn)錄因子中篩選出了NFIA、NFIB和SOX9三個(gè)因子，可以把人和大鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成有功能的誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞［6］。Marius Wernig實(shí)驗(yàn)室則篩選出Sox10、Olig2和Zfp536三個(gè)因子制備出了高效率的誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)把它們移植到髓鞘堿性蛋白基因敲除小鼠的胼胝體和小腦后，它們可以分化成為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，并且還可以形成包裹了軸突的髓鞘［7］。Eva C. Thoma等則僅用一種化合物：多激酶抑制劑化合物B，就將包皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成了施旺細(xì)胞，這些施旺細(xì)胞可以形成髓鞘，而且還具有電生理功能［8］。這些研究為治療周圍神經(jīng)損傷帶來(lái)了新的希望。

3. 其他誘導(dǎo)方法

3.1. 小分子誘導(dǎo)

在所有的重編程轉(zhuǎn)分化的策略中，小分子誘導(dǎo)具有無(wú)基因組整合，操作簡(jiǎn)單，劑量易控與可逆性等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注。小分子可以通過(guò)調(diào)控表觀遺傳修飾，信號(hào)通路與代謝激酶等多種途徑來(lái)影響細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變過(guò)程，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)重編程效率的提升并替代相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。第一次完全由小分子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞是2015年Ping Dai等人用6個(gè)確定的化合物完成的，他們的轉(zhuǎn)化效率能達(dá)到80%，而且不受細(xì)胞來(lái)源的年齡和培養(yǎng)代數(shù)的影響［9］。3個(gè)月后，上海生命科學(xué)研究院的裴剛實(shí)驗(yàn)室也發(fā)表文章，表明他們用了7個(gè)化合物將正常人和阿爾茨海默病患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成了神經(jīng)元細(xì)胞［10］。同時(shí)，同濟(jì)大學(xué)仁濟(jì)醫(yī)院的Huiming Xu等人，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3基因修飾的嗅鞘細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中加入SB431542、GDNF和RA三種小分子化合物，經(jīng)過(guò)三周的培養(yǎng)，成功的將小鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為了氨基丁酸能神經(jīng)元。這種神經(jīng)元的損傷或缺乏可以導(dǎo)致癲癇和自閉癥譜系神經(jīng)障礙［11］。

3.2. microRNA誘導(dǎo)

microRNA作為內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈分子，不翻譯成蛋白質(zhì)，但參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要作用，可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。Andrew S. Yoo等人的研究表明，miR-9/9*-124在神經(jīng)元細(xì)胞命運(yùn)決定中起重要作用，過(guò)表達(dá)它們可以使人的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為神經(jīng)元細(xì)胞，NEUROD2、ASCL1和MYT1L可以促進(jìn)這個(gè)過(guò)程［12］。Zhou Chen等人發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)多能性干細(xì)胞特異性miRNA簇miRNA-302/367和另外兩個(gè)神經(jīng)特異性miRNA，包括miRNA-9/9*和miRNA-124可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元［13］。Yuanchao Xue等人則發(fā)現(xiàn)，通過(guò)miR-124抑制單個(gè)RNA結(jié)合多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白（PTB）可以誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為功能性神經(jīng)元［14］。

4. 間接轉(zhuǎn)分化

由于終末的或半終末的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化存在一些缺陷，終末細(xì)胞擴(kuò)增能力有限，分化效率比較低，而且移植后的存活率以及功能性整合率都比較低，所以人們又傾向于采用間接轉(zhuǎn)分化的方法，就是將一種成熟細(xì)胞重編程成為一種具有可塑性的中間狀態(tài)，如干細(xì)胞或前體細(xì)胞，然后再誘導(dǎo)成我們要的功能細(xì)胞。

4.1. 誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（inducedneural stem cells, iNSCs）

誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（iNSCs）具有很強(qiáng)的可塑性和分化再生的能力，并且可以抗炎抗凋亡，具有免疫調(diào)節(jié)的作用。Marc Thier等在小鼠成纖維細(xì)胞中通過(guò)先短暫表達(dá)Oct4，再持續(xù)高表達(dá)Sox2、Klf4和c-Myc，得到了可以在體外傳代超過(guò)50代的誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（inducedneural stem cells, iNSCs），這些iNSCs與神經(jīng)干細(xì)胞NSCs有著類似的表型和基因型，并可以分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞［15］。

4.2. 誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞（inducedneural progenitor cells, iNPCs）

中科院潘光錦課題組在人體的尿液上皮細(xì)胞中利用隨體過(guò)表達(dá)4個(gè)Yamanaka因子，Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，并在誘導(dǎo)期間的不同時(shí)間段加入6個(gè)小分子化合物，結(jié)果得到了類似于神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞（iNPCs），這些非轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞可以自我更新并在體外分化成多種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并可在新生小鼠的腦中移植成活和分化［16］。

Mi-Sun Lim等在小鼠成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Bcl-xL和Myt1L可將其誘導(dǎo)成為誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞，這種iNPCs可以擴(kuò)增超過(guò)100倍，在過(guò)表達(dá)Nurr1和Foxa2后產(chǎn)生具有突觸前神經(jīng)元的功能的成熟的中腦多巴胺能神經(jīng)元，并在帕金森氏病模型小鼠的治療上有一定的潛力［17］。

4.3. 神經(jīng)限制性前體細(xì)胞

鑒于誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞和誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞在移植后增殖能力有限、存活率低，而且主要分化方向是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，只有很少量的細(xì)胞可以分化為有功能的神經(jīng)元，Changhai Tian等通過(guò)異位表達(dá)Brn2、Sox2和Foxa2將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)限制性前體細(xì)胞，這種細(xì)胞只向神經(jīng)元分化，并且有較強(qiáng)的再生和遷移能力，在帕金森氏病模型鼠大腦移植后可以緩解功能性運(yùn)動(dòng)障礙，并減少紋狀體DA神經(jīng)元軸突目的地的損失。而且最重要的是在移植后的小鼠大腦中檢測(cè)不到星形膠質(zhì)細(xì)胞和腫瘤［18］。

   結(jié)語(yǔ)

目前，皮膚細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）已經(jīng)可以成功的被轉(zhuǎn)化成各種神經(jīng)細(xì)胞，而且這些細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也可以產(chǎn)生一定的功能，但是要走向臨床還存在著不少的問(wèn)題，比如轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞的免疫原性，轉(zhuǎn)分化藥物（小分子化合物）的毒性，轉(zhuǎn)化效率以及移植的存活率，以及它們與機(jī)體原有的神經(jīng)細(xì)胞如何整合等等，還有很多的研究工作需要進(jìn)行。其中導(dǎo)入特定基因的方法效率較高，但有較高的成瘤性危險(xiǎn)，引入合成mRNA誘導(dǎo)或用小分子誘導(dǎo)的方法可以避免病毒引起的基因組整合，可以提高轉(zhuǎn)化的安全性，是未來(lái)這一領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。同時(shí)，對(duì)皮膚細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化的研究，也有助于我們了解細(xì)胞命運(yùn)決定以及生物發(fā)育的深層規(guī)律，為進(jìn)一步的研究工作打下基礎(chǔ)。

 

 

參考文獻(xiàn)：

［1］Vogel G. How can a skin cell become a nerve cell? Science. 2005 Jul1;309(5731):85.

［2］Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, et al. Direct conversion offibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 2010 Feb25;463(7284):1035-41.

［3］Ambasudhan R, Talantova M, Ding S, et al. Direct reprogramming ofadult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. CellStem Cell. 2011 Aug 5;9(2):113-8.

［4］Dell'Anno MT, Caiazzo M, Leo D, Dvoretskova E, et al. Remote controlof induced dopaminergic neurons in parkinsonian rats. J Clin Invest. 2014Jul;124(7):3215-29.

［5］Son EY, Ichida JK, Wainger BJ, et al. Conversion of mouse and humanfibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 2011 Sep2;9(3):205-18.

［6］Caiazzo M, Giannelli S, Valente P, et al. Direct conversion offibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors. StemCell Reports. 2015 Jan 13;4(1):25-36.

［7］Yang N, Zuchero JB, Ahlenius H, et al. Generation ofoligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 2013May;31(5):434-9.

［8］Thoma EC, Merkl C, Heckel T, et al. Chemical conversion of humanfibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 2014 Oct14;3(4):539-47.

［9］Dai P, Harada Y, Takamatsu T. Highly efficient direct conversion ofhuman fibroblasts to neuronal cells by chemical compounds. J Clin Biochem Nutr.2015 May;56(3):166-70.

［10］Hu W, Qiu B, Guan W, et al. Direct Conversion of Normal andAlzheimer's Disease Human Fibroblasts into Neuronal Cells by Small Molecules.Cell Stem Cell. 2015 Aug 6;17(2):204-12.

［11］Xu H, Wang Y, He Z, et al. Direct conversion of mouse fibroblasts toGABAergic neurons with combined medium without the introduction oftranscription factors or miRNAs. Cell Cycle. 2015 Aug 3;14(15):2451-60.

［12］Andrew S. Yoo, Sun AX, Li L, et al. MicroRNA-mediated conversion ofhuman fibroblasts to neurons. Nature. 2011 Jul 13;476(7359):228-31.

［13］Zhou Chen, Gu H, Fan R, et al. MicroRNA 302/367 Cluster EffectivelyFacilitates Direct Reprogramming from Human Fibroblasts into FunctionalNeurons. Stem Cells Dev. 2015 Dec 1;24(23):2746-55.

［14］Yuanchao Xue, Ouyang K, Huang J, et al. Direct conversion offibroblasts to neurons by reprogramming PTB-regulated microRNA circuits. Cell.2013 Jan 17;152(1-2):82-96.

［15］Marc Thier, Wörsdörfer P, Lakes YB, et al. Direct conversion offibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 2012 Apr6;10(4):473-9.

［16］Wang L, Wang L, Huang W, et al. Generation of integration-freeneural progenitor cells from cells in human urine. Nat Methods. 2013Jan;10(1):84-9.

［17］Mi-Sun Lim, Chang MY, Kim SM, et al. Generation of Dopamine Neuronsfrom Rodent Fibroblasts through the Expandable Neural Precursor Cell Stage. JBiol Chem. 2015 Jul 10;290(28):17401-14.

［18］Changhai Tian, Li Y, Huang Y, et al. Selective Generation ofDopaminergic Precursors from Mouse Fibroblasts by Direct Lineage Conversion. SciRep. 2015 Jul 30;5:12622.

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